純化重組蛋白時(shí)，若出現(xiàn)目標(biāo)蛋白與雜蛋白分子量接近的情況，除了親和層析，還可結(jié)合哪些層析技術(shù)（如離子交換層析、疏水相互作用層析）進(jìn)行分
日期：2025-09-24 17:01:44
在純化重組蛋白時(shí)，若目標(biāo)蛋白與雜蛋白分子量接近（親和層析難以完全分離），可根據(jù)兩者在電荷、疏水性、等電點(diǎn)、分子構(gòu)象等理化性質(zhì)的差異，結(jié)合以下層析技術(shù)實(shí)現(xiàn)有效分離，核心思路是利用非分子量相關(guān)的特性差異構(gòu)建分離條件：
一、核心可結(jié)合的層析技術(shù)及分離原理
一、核心可結(jié)合的層析技術(shù)及分離原理
1. 離子交換層析（Ion Exchange Chromatography, IEC）
分離核心：基于目標(biāo)蛋白與雜蛋白表面凈電荷差異（如羧基、氨基數(shù)量不同），在特定 pH 緩沖液中與離子交換樹脂（帶正電/負(fù)電）的結(jié)合能力不同，通過改變緩沖液鹽濃度（如NaCl梯度）洗脫，實(shí)現(xiàn)分離。
適用場(chǎng)景：當(dāng)目標(biāo)蛋白與雜蛋白等電點(diǎn)（pI）差異≥0.5 時(shí)，分離效果顯著。
例：若目標(biāo)蛋白pI=7.5（中性偏堿，酸性條件下帶正電），雜蛋白 pI=5.0（酸性，酸性條件下帶負(fù)電），可選用陽離子交換樹脂（如SP Sepharose），在 pH=6.0 的緩沖液中，目標(biāo)蛋白結(jié)合樹脂，雜蛋白直接流穿，再用高鹽洗脫目標(biāo)蛋白。
2. 疏水相互作用層析（Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC）
分離核心：基于目標(biāo)蛋白與雜蛋白表面疏水性氨基酸殘基暴露程度差異，在高鹽緩沖液中，疏水性強(qiáng)的蛋白與HIC樹脂（如苯基、辛基修飾）結(jié)合更緊密，通過降低鹽濃度（如硫酸銨梯度降低），使疏水性弱的蛋白先洗脫，實(shí)現(xiàn)分離。
適用場(chǎng)景：兩者分子量接近但疏水性差異大（如目標(biāo)蛋白含較多疏水結(jié)構(gòu)域，雜蛋白為親水性蛋白），或經(jīng)鹽析沉淀后需進(jìn)一步純化時(shí)。
例：純化抗體片段時(shí)，若目標(biāo)片段疏水性高于雜蛋白，可在 2M 硫酸銨緩沖液中上樣至苯基瓊脂糖樹脂，雜蛋白因疏水性弱先流穿，目標(biāo)片段則需用 0.5M 硫酸銨緩沖液洗脫。
3. 等電聚焦層析（Isoelectric Focusing Chromatography, IEF）
分離核心：利用兩性電解質(zhì)形成pH 梯度，目標(biāo)蛋白與雜蛋白會(huì)遷移至自身pI對(duì)應(yīng)的pH區(qū)域（此處凈電荷為0，停止遷移），通過收集不同 pH 區(qū)間的組分實(shí)現(xiàn)分離。
優(yōu)勢(shì)：分辨率極高，可區(qū)分 pI 差異僅0.1-0.2的蛋白，適合分子量接近但 pI 差異明確的場(chǎng)景；但操作較復(fù)雜，需專用設(shè)備（如 IEF 柱），且不適合大規(guī)模制備（更常用于分析或小規(guī)模純化）。
4. 羥基磷灰石層析（Hydroxyapatite Chromatography, HAC）
分離核心：基于蛋白與羥基磷灰石（Ca??(PO?)?(OH)?）樹脂的雙重作用：一是蛋白表面羧基與樹脂中 Ca²?的靜電結(jié)合，二是蛋白氨基與樹脂中 PO?³?的親和作用，通過改變磷酸緩沖液濃度（如 0.01-0.5M Na?HPO?梯度），調(diào)節(jié)結(jié)合強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)分離。
適用場(chǎng)景：當(dāng)離子交換層析無法區(qū)分（如 pI 接近），但蛋白表面羧基 / 氨基分布差異大時(shí)（如目標(biāo)蛋白含較多磷酸化位點(diǎn)，與 Ca²?結(jié)合更強(qiáng)），HAC 可作為補(bǔ)充手段，尤其適合抗體、酶類蛋白的精細(xì)純化。
二、關(guān)鍵操作注意事項(xiàng)（通用原則）
前處理適配：
上樣前需確保樣品與層析緩沖液pH、鹽濃度一致（如 IEC 需調(diào)節(jié)樣品 pH 至樹脂適用范圍，HAC 需用低濃度磷酸緩沖液平衡），避免因條件突變導(dǎo)致蛋白沉淀或非特異性結(jié)合。
樣品需離心（12000rpm, 10min）或過濾（0.22μm 膜），去除雜質(zhì)，防止堵塞層析柱。
梯度洗脫優(yōu)化：
避免使用 “陡梯度”（如鹽濃度驟升），優(yōu)先采用線性梯度洗脫（如IEC中NaCl從0.1M緩慢升至 1M，持續(xù)20-30個(gè)柱體積），可更清晰地分開目標(biāo)蛋白與雜蛋白的洗脫峰，減少交叉污染。
與親和層析的銜接：
通常建議先進(jìn)行 “粗純化”（如離子交換層析去除大部分雜蛋白），再用親和層析（如 His-tag、GST-tag）捕獲目標(biāo)蛋白，最后用HIC或IEF進(jìn)行 “精細(xì)純化”，形成 “多步層析組合”，最大化提高純度（純度可達(dá)95%以上）。
當(dāng)目標(biāo)蛋白與雜蛋白分子量接近時(shí)，核心是通過 “電荷、疏水性、pI” 等特性差異選擇層析技術(shù)，實(shí)際應(yīng)用中常需2-3種技術(shù)組合（如 “離子交換 + 疏水相互作用”），并結(jié)合緩沖液條件優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)高效分離。
