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構建大腸桿菌表達載體時,需包含哪些關鍵元件??

日期:2025-11-20 14:37:22

    大腸桿菌表達載體的關鍵元件需覆蓋“復制、表達、篩選、純化”四大功能,共8類核心元件,缺一不可。
 
一、核心功能元件及作用
    復制起點(ori):控制質粒在大腸桿菌內的復制,決定拷貝數。高拷貝質粒(如pUC系列)適合大量表達,低拷貝質粒(如pET系列部分載體)適合毒性蛋白表達。
啟動子:啟動目的基因轉錄的關鍵元件,需根據表達需求選擇。常用強啟動子有T7、lac、trc,其中T7啟動子可控性強、表達效率高,是最常用選擇。
    核糖體結合位點(RBS):位于起始密碼子上游,提供核糖體結合區域,其序列和間距直接影響翻譯效率,需與目的基因匹配。
    多克隆位點(MCS):集中多個限制性內切酶酶切位點,用于插入目的基因,需避免酶切位點與目的基因內部序列沖突。
    終止子:終止轉錄過程,分為依賴ρ因子和不依賴ρ因子兩類,常用T7終止子、rrnB終止子,防止轉錄通讀影響質粒穩定性。
    篩選標記基因:用于篩選成功轉化的工程菌,常見抗生素抗性基因(氨芐青霉素抗性、卡那霉素抗性),或營養缺陷型互補基因。
    融合標簽(可選但常用):便于目的蛋白純化和檢測,如His標簽、GST標簽、Flag標簽,需注意標簽位置(N端或C端)不影響蛋白活性。
    信號肽(可選):若需分泌型表達,需添加信號肽序列(如OmpA、PelB),引導蛋白分泌至細胞周質或培養基。
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二、元件組合的關鍵原則
    兼容性:啟動子需與宿主菌匹配(如T7啟動子需宿主菌含T7RNA聚合酶基因,如BL21(DE3))。
    方向性:目的基因插入需保證閱讀框正確,與RBS、啟動子的間距符合表達要求(通常RBS與起始密碼子間距3-12bp)。
    穩定性:避免元件間序列重復,防止質粒重組丟失,同時終止子需有效終止轉錄,減少質粒負擔。