客戶提供基因序列后，抗體公司會進行哪些前期分析提升蛋白表達成功率？
日期：2025-11-26 11:38:32
一、核心基礎：基因序列完整性與正確性驗證?
分析目的：排除原始序列錯誤，確保靶標基因無缺失、突變或污染，為后續優化提供可靠模板。?
1、具體操作：?
比對客戶提供的序列與NCBI、Uniprot等數據庫中的參考序列（如靶標基因的野生型序列、同源物種序列），確認基因名稱、物種來源、編碼區（CDS）范圍是否一致；?
檢查序列格式：剔除多余的非編碼區（如啟動子、終止子上下游無關序列）、驗證起始密碼子（ATG）和終止密碼子（TAA/TAG/TGA）的完整性，避免移碼突變；?
排查稀有酶切位點：若后續需載體構建，需避免靶標序列中含載體多克隆位點（MCS）的酶切位點，防止構建時基因斷裂。?
二、關鍵優化：密碼子偏好性優化（提升翻譯效率）?
分析目的：不同表達系統（大腸桿菌、CHO細胞、昆蟲細胞等）的密碼子使用頻率差異極大，優化后可減少“稀有密碼子導致的翻譯停滯”，提升蛋白產量。?
1、具體操作：?
確定表達系統：根據客戶需求（如蛋白是否需糖基化修飾）選定系統后，調取該系統的密碼子偏好性數據庫（如大腸桿菌的密碼子使用表、CHO細胞的高頻密碼子清單）；?
2、優化原則：?
將靶標序列中“低使用頻率密碼子”替換為表達系統的“高頻密碼子”（如大腸桿菌中Arg的稀有密碼子AGG/AGA，替換為高頻的CGT/CGC）；?
避免連續稀有密碼子（≥3個），防止核糖體停滯導致翻譯中斷；?
保留功能關鍵密碼子：若某密碼子對應蛋白活性中心的氨基酸，需確認替換后不改變氨基酸種類（同義替換）；?
平衡GC含量：優化后GC含量控制在35%-65%（大腸桿菌偏50%-60%，真核細胞偏40%-55%），避免過高導致DNA二級結構（如發夾結構），影響轉錄。?
三、結構預測：信號肽與亞細胞定位分析（定向分泌/可溶性表達）?
分析目的：判斷靶標蛋白是否含信號肽，以及最佳的表達定位（胞內/胞外/膜上），避免蛋白滯留導致的降解或不溶性聚集。?
1、具體操作：?
信號肽預測：使用SignalP（主流工具）分析序列N端是否存在信號肽（通常15-30個氨基酸的疏水區），預測信號肽的切割位點；?
若為分泌型蛋白（如細胞因子、抗體）：保留天然信號肽或替換為表達系統的強信號肽（如大腸桿菌的OmpA信號肽、CHO細胞的IgGκ信號肽），引導蛋白分泌到胞外，便于純化；?
若為胞內蛋白：剔除冗余信號肽，避免錯誤分泌導致的蛋白折疊異常；?
亞細胞定位預測：用TargetP、PSORTⅡ等工具預測蛋白天然定位（細胞質、細胞核、細胞膜等），若客戶需胞外表達，需調整信號肽確保分泌效率。?
四、可溶性優化：親疏水性與跨膜區分析（減少包涵體）?
分析目的：疏水性氨基酸過多或跨膜區存在，易導致蛋白在表達系統中形成不溶性包涵體（尤其原核系統），需通過序列調整提升可溶性。?
1、具體操作：?
親疏水性分析：用ProtScale工具繪制氨基酸親疏水性圖譜，識別連續疏水區（≥20個疏水氨基酸）；?
2、處理方案：?
若為膜蛋白：保留核心跨膜區，截斷非功能區的疏水區，或選擇適合膜蛋白表達的系統（如昆蟲細胞+桿狀病毒）；?
若為可溶性蛋白：通過替換部分疏水氨基酸（如Leu→Ser、Val→Thr，需不影響蛋白活性）、添加可溶性標簽（如GST、MBP）的方式，降低聚集風險；?
避免疏水簇：分散連續的疏水氨基酸，防止蛋白內部或蛋白間形成疏水相互作用導致聚集。?
五、穩定性保障：二級結構與RNA二級結構分析（防止轉錄/翻譯受阻）?
分析目的：基因序列的二級結構（如發夾、莖環）會阻礙RNA聚合酶轉錄或核糖體結合，需通過序列調整消除。?
1、具體操作：?
mRNA二級結構預測：用RNAfold工具分析轉錄后的mRNA序列，重點排查核糖體結合位點（RBS，原核系統）、起始密碼子附近（-30~+30bp）是否存在強二級結構（自由能＜-20kcal/mol）；?
優化策略：通過同義密碼子替換，破壞強發夾結構（如調整堿基組成，減少GC配對），確保mRNA能順利結合核糖體；?
蛋白二級結構預測：用SOPMA工具分析α-螺旋、β-折疊、無規則卷曲的分布，避免在活性中心附近出現過多無序結構，提升蛋白穩定性。?
六、風險規避：重復序列與毒性肽段分析（減少表達失?。?
分析目的：排除可能導致表達系統毒性、基因重組不穩定的序列風險。?
1、具體操作：?
重復序列檢測：用TandemRepeatsFinder工具排查靶標序列中的串聯重復序列（如(AAG)n、(GGT)n），重復次數≥5次易導致DNA復制時滑移，引發基因缺失，需通過同義替換打散重復單元；?
毒性肽段預測：用TOXIPRED等工具分析是否含對表達系統有毒性的肽段（如部分抗菌肽、細胞毒性片段），若存在，需與客戶溝通是否截斷或突變毒性位點；?
稀有順式元件排查：原核系統中需避免含大腸桿菌的終止子序列（如rho因子依賴型終止子）、真核系統中避免含過多內含子片段（非整合型載體），防止轉錄提前終止。?
七、功能保留：活性位點與修飾位點分析（確保蛋白功能）?
分析目的：優化序列的同時，必須保留蛋白的功能關鍵位點，避免因優化導致抗體識別失效。?
1、具體操作：?
活性位點預測：通過同源建模（SWISS-MODEL）構建蛋白三維結構，結合Uniprot數據庫中的功能注釋，定位抗原表位、酶活性中心、配體結合位點等關鍵區域；?
修飾位點分析：預測糖基化（NetNGlyc/NetOGlyc）、磷酸化（NetPhos）、二硫鍵（DiANNA）等修飾位點，確保優化后不破壞這些位點（如糖基化位點的Asn-X-Ser/Thr序列需保留）；?
保守區分析：用ClustalX比對靶標蛋白與同源蛋白的保守序列，保守區通常是功能核心，優化時需最小化改動。?
八、載體適配：酶切位點與標簽設計（便于構建與純化）?
分析目的：將優化后的基因序列與表達載體無縫銜接，同時設計標簽提升純化效率和檢測便利性。?
1、具體操作：?
酶切位點匹配：根據選定載體的多克隆位點（MCS），在靶標基因兩端添加對應的酶切位點（如BamHⅠ、EcoRⅠ），確保酶切后能定向插入載體；?
2、標簽設計：?
純化標簽：N端或C端添加His-tag（6×His，最常用）、GST-tag、MBP-tag等，便于后續鎳柱、谷胱甘肽柱純化；?
檢測標簽：若需后續蛋白定量或WesternBlot驗證，可添加FLAG-tag、Myc-tag等；?
標簽位置：避免標簽遮擋活性位點（如抗原表位），通常選擇C端（不影響信號肽功能）或N端（需在信號肽之后）；?
終止密碼子添加：若載體無內置終止密碼子，需在靶標序列C端（標簽之后）添加終止密碼子，確保翻譯準確終止。
