標(biāo)簽內(nèi)參抗體與目標(biāo)蛋白抗體進(jìn)行共檢測時(shí)，需注意哪些實(shí)驗(yàn)條件？
日期：2025-11-20 14:34:34
共檢測的關(guān)鍵是避免抗體交叉干擾、保證兩者充分結(jié)合，實(shí)驗(yàn)條件需圍繞“抗體兼容性、孵育順序、信號區(qū)分”三大核心把控。
一、抗體選擇的核心注意事項(xiàng)
種屬來源無交叉：目標(biāo)蛋白抗體與標(biāo)簽內(nèi)參抗體需來自不同種屬，比如目標(biāo)抗體用兔抗，內(nèi)參抗體用鼠抗，避免二抗交叉識別。
抗體類型匹配：優(yōu)先選擇單克隆抗體，特異性更強(qiáng)，減少非特異性結(jié)合；若用多克隆抗體，需提前驗(yàn)證無交叉反應(yīng)。
標(biāo)簽與目標(biāo)蛋白無干擾：確保標(biāo)簽內(nèi)參（如GAPDH、β-actin）與目標(biāo)蛋白的分子量差異明顯（通常≥5kDa），避免電泳分離時(shí)重疊。
二、孵育順序的優(yōu)化選擇
同步孵育（推薦優(yōu)先嘗試）：將目標(biāo)蛋白抗體和標(biāo)簽內(nèi)參抗體按比例混合，同時(shí)加入膜上或樣本中孵育。
適用場景：兩種抗體種屬不同、無交叉反應(yīng)，可節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間。
關(guān)鍵要點(diǎn)：抗體濃度需適當(dāng)降低（比單獨(dú)孵育低30%-50%），避免抗原結(jié)合位點(diǎn)競爭。
分步孵育（適合抗體兼容性未知時(shí)）：先孵育目標(biāo)蛋白抗體，洗膜后再孵育標(biāo)簽內(nèi)參抗體。
適用場景：目標(biāo)蛋白表達(dá)量低，需優(yōu)先保證其結(jié)合；或懷疑抗體可能存在輕微交叉。
關(guān)鍵要點(diǎn)：第一步孵育的抗體需充分洗滌（3次×5分鐘），避免殘留影響后續(xù)結(jié)合。
三、其他關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)條件控制
二抗選擇：使用針對兩種抗體種屬的混合二抗（如羊抗兔+羊抗鼠），或分別標(biāo)記不同熒光基團(tuán)的二抗（適用于熒光檢測），確保信號可區(qū)分。
孵育溫度與時(shí)間：同步孵育建議4℃過夜，分步孵育可室溫1小時(shí)+4℃過夜，保證抗體充分結(jié)合。
洗滌條件：每次孵育后用含0.1%Tween-20的TBST充分洗滌，減少非特異性背景，避免抗體殘留導(dǎo)致的信號干擾。
信號檢測：若為化學(xué)發(fā)光檢測，需確保兩種抗體對應(yīng)的信號強(qiáng)度匹配（可通過調(diào)整二抗?jié)舛葘?shí)現(xiàn)），避免強(qiáng)信號掩蓋弱信號。
