標簽內參抗體能否用于驗證融合蛋白在細胞中的表達情況？
日期：2025-10-20 15:50:34
標簽內參抗體可以用于驗證融合蛋白在細胞中的表達情況，但需結合實驗設計和抗體特性合理使用，同時要注意其局限性，不能完全替代針對融合蛋白自身序列的抗體。
一、標簽內參抗體適用的核心場景
一、標簽內參抗體適用的核心場景
當融合蛋白的自身抗體難以獲取（如定制抗體周期長、成本高），或需快速驗證表達時，標簽內參抗體是高效選擇，主要適用于以下場景：
快速初篩表達與否：若融合蛋白攜帶常見標簽（如His、Flag、Myc、HA），可直接使用對應的標簽內參抗體，通過WB、IF等實驗檢測細胞裂解液或細胞樣本。只要檢測到目標分子量的條帶或特異性熒光信號，即可初步證明融合蛋白已在細胞中表達。
標準化表達量對比：在不同實驗條件（如不同轉染效率、不同誘導時間）下，用標簽內參抗體檢測融合蛋白，可排除樣本加載量差異的影響，更準確地對比融合蛋白的相對表達水平。例如，通過WB實驗中標簽抗體條帶的灰度值，量化不同組別的表達差異。
驗證表達定位：利用熒光標記的標簽內參抗體（如熒光二抗偶聯的Flag抗體），通過免疫熒光（IF）實驗觀察融合蛋白在細胞內的定位（如細胞核、細胞質、細胞膜），無需單獨制備針對融合蛋白自身的熒光抗體。
二、使用時必須注意的局限性
標簽內參抗體雖便捷，但無法完全反映融合蛋白的真實狀態，需通過對照實驗規避以下問題：
無法排除標簽游離或蛋白降解：若融合蛋白在細胞內發生部分降解，可能僅殘留帶有標簽的片段，此時標簽內參抗體會檢測到信號，但實際完整的融合蛋白已不存在。需結合融合蛋白的預期分子量（通過WB條帶大小）判斷，或搭配針對融合蛋白另一端序列的抗體（若有）交叉驗證。
不能區分融合蛋白與其他帶相同標簽的蛋白：若細胞內同時表達其他攜帶相同標簽的外源蛋白（如共轉染的其他標簽載體），或細胞自身存在與標簽非特異性結合的成分，標簽內參抗體會產生假陽性信號。需設置空白對照（未轉染融合蛋白的細胞）和陰性對照（轉染空標簽載體的細胞），排除非特異性信號干擾。
無法驗證融合蛋白的功能性：標簽內參抗體僅能證明“蛋白存在”，但不能驗證融合蛋白是否正確折疊、是否形成預期構象，或是否具有生物學活性（如酶活性、結合能力）。若需驗證功能，還需結合功能性實驗（如酶活測定、IP檢測互作蛋白）。
三、關鍵使用建議
為確保結果可靠，使用標簽內參抗體驗證融合蛋白表達時，需遵循以下3點建議：
嚴格設置對照實驗：必須包含3類對照——空白對照（未轉染細胞）、陰性對照（轉染空標簽載體細胞）、陽性對照（轉染已知可表達的標簽融合蛋白細胞），通過對照排除非特異性結合和實驗體系誤差。
結合分子量判斷完整性：在WB實驗中，需根據融合蛋白的理論分子量（標簽分子量+目標蛋白分子量）判斷條帶位置。若檢測到的條帶遠小于理論分子量，需警惕蛋白降解，此時標簽信號不能代表完整融合蛋白的表達。
優先選擇高特異性標簽抗體：不同標簽抗體的特異性差異較大，例如His抗體易與細胞內組氨酸含量高的蛋白非特異性結合，而Flag、Myc抗體的特異性通常更高。建議選擇經過驗證、適用于細胞樣本的標簽內參抗體，減少假陽性。
