終止液的作用是什么，加入終止液后需要在多長時間內讀取ELISA檢測結果？

日期：2025-09-16 14:33:26

在ELISA檢測中，終止液是確保反應精準可控、結果穩定可讀的關鍵試劑，其作用和后續讀數時間均需嚴格遵循規范，否則會直接影響結果準確性。以下是具體解析：

一、終止液的核心作用：終止酶促反應，固定檢測信號

ELISA的信號檢測依賴酶促底物反應（如辣根過氧化物酶 HRP 催化 TMB 底物、堿性磷酸酶 AP 催化 pNPP 底物）—— 酶與底物反應會產生顏色變化（或化學發光），顏色深淺與樣本中目標抗原濃度正相關。但酶促反應是 “持續進行” 的，若不及時終止，顏色會持續加深（或信號衰減），導致不同樣本的檢測信號無法在同一 “時間節點” 對比，最終出現結果偏差。

終止液的作用本質是特異性抑制酶的活性，快速終止底物反應，使所有樣本的信號（顏色或光信號）固定在同一狀態，為后續讀數提供穩定、可比的基礎。具體功能可分為3點：

1、終止酶活性，固定信號

終止液通過改變反應體系的關鍵條件（如 pH 值），使酶的空間結構被破壞（如 HRP 的最適 pH 為 7.0-7.5，終止液多為強酸，可將 pH 降至 2.0 以下，直接滅活 HRP），徹底停止酶對底物的催化，避免信號持續變化（如 TMB 底物若不終止，藍色會逐漸變為棕色，且顏色深度不再與濃度正相關）。

2、優化信號讀取（針對比色法 ELISA）

部分終止液可同步改變反應產物的顏色，使其更適配酶標儀的檢測波長，提升信號靈敏度。例如：HRP-TMB 體系中，底物反應產生的藍色產物（氧化型 TMB）在強酸終止液（如 2M H?SO?）作用下，會轉化為更穩定的黃色產物，而酶標儀對黃色的檢測波長（通常 450nm）更靈敏，可降低背景噪音。

3、保護檢測系統

若酶促反應持續進行，過量的反應產物（如氧化型 TMB）可能沉積在酶標板孔壁，不僅影響當前讀數，還可能污染酶標儀的檢測光路，長期導致儀器靈敏度下降。終止液終止反應后，可避免產物過度積累，保護檢測系統。

二、加入終止液后，需在10-30 分鐘內讀取結果

終止液雖能固定信號，但并非 “永久穩定”—— 終止后的反應產物（如黃色 TMB 產物）會隨時間推移發生緩慢降解（如光氧化、酸堿環境下的分解），導致顏色逐漸變淺，信號強度下降，最終偏離真實值。因此，加入終止液后需在規定時間內完成讀數，具體要求如下：

1. 通用時間范圍：10-30 分鐘（以試劑盒說明書為準）

多數商用 ELISA 試劑盒的說明書會明確標注 “終止后 XX 分鐘內讀數”，常規范圍10-30分鐘。

為何不立即讀數？剛加入終止液時，液體可能存在 “局部濃度不均”（如終止液未與孔內反應液充分混勻），導致同一孔內顏色深淺不一，立即讀數會出現誤差；靜置10分鐘可使液體充分混勻，信號達到穩定狀態。

為何不超過 30 分鐘？30 分鐘后，終止液中的酸（如 H?SO?）可能與酶標板材質（如聚苯乙烯）發生輕微反應，或產物在光照、室溫下緩慢分解（如黃色產物遇光易氧化褪色），導致信號強度下降，尤其是低濃度樣本的信號衰減更明顯，最終影響結果準確性。

2. 特殊情況：需嚴格遵循試劑盒說明書

不同酶-底物體系的終止液成分、產物穩定性不同，部分試劑盒會有特殊時間要求，需優先以說明書為準：

例如：使用化學發光底物的 ELISA（如 HRP - 魯米諾體系），終止液作用是 “淬滅發光信號”，而非固定顏色，這類體系的讀數需在終止后5 分鐘內完成（發光信號淬滅后會快速衰減）；

又如：部分 AP-pNPP 體系的終止液（如 NaOH），產物（黃色 pNP）穩定性稍高，說明書可能允許 “終止后 1 小時內讀數”，但仍需避免長時間放置。

3. 讀數前的關鍵準備：確保樣本混勻、避免氣泡

加入終止液后，需輕輕振蕩酶標板（或用移液器吹吸 1-2 次，避免產生氣泡），確保終止液與孔內反應液充分混勻 —— 若混勻不充分，孔內局部仍有未終止的酶促反應，會導致顏色不均，讀數時出現 “孔內吸光度差異大” 的問題；同時，孔內若有氣泡，會遮擋光路，導致讀數偏低（氣泡會反射或散射光線，使酶標儀檢測到的光信號減弱）。

總結

終止液的核心作用：特異性滅活酶活性，終止底物反應，固定檢測信號（部分可優化信號顏色），確保所有樣本的信號處于同一穩定狀態，為讀數提供可比基礎；

讀數時間要求：加入終止液后需在10-30 分鐘內完成讀數（具體以試劑盒說明書為準），過早（混勻不充分）或過晚（信號衰減）均會導致結果偏差；

關鍵注意點：加入終止液后需充分混勻（避免局部反應），并排除孔內氣泡（避免光路遮擋），確保讀數條件統一。