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加完終止液后,需多久內完成ELISA試劑盒讀數?

日期:2025-09-02 16:58:31

    在ELISA實驗中,加完終止液后需嚴格控制讀數時間,核心原則是 “在終止反應后的‘穩定窗口期’內完成讀數”,通常要求15-30分鐘內完成,具體需以試劑盒說明書為準(不同底物系統的穩定時間差異較大)。以下從 “時間要求的核心原因”“不同底物的具體差異”“操作注意事項” 三方面詳細說明:

一、為什么必須限時讀數?—— 終止液的作用與信號穩定性原理
    終止液的核心功能是立即終止酶(如HRP、AP)與底物的催化反應,使所有反應孔的 “顯色信號” 停留在同一時間點,確保讀數結果能反映樣本中目標分子的真實濃度。但終止后,顯色信號并非永久穩定,會因以下原因隨時間推移發生變化,導致結果偏差:
 
    底物氧化/降解:終止液雖停止酶促反應,但顯色產物(如 TMB 的藍色產物、OPD的黃色產物)在室溫下仍可能被空氣中的氧氣氧化,或因 pH 變化(終止液多為強酸 / 強堿,如硫酸、氫氧化鈉)緩慢降解,導致吸光度(OD值)逐漸升高或降低;
    非特異性反應殘留:若終止不徹底(或終止后放置過久),微量未被完全抑制的酶可能繼續微弱催化反應,導致信號漂移;
    溶液狀態變化:部分底物(如TMB)的終止產物在長期放置后可能出現輕微沉淀,導致OD值假性升高,或因蒸發導致濃度變化(尤其開放式孵育時)。
 
限時讀數的目的是捕捉 “反應完全終止、信號尚未發生顯著變化” 的穩定狀態,避免信號漂移影響結果準確性。
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二、不同底物系統的讀數時間差異(以常見底物為例)
    ELISA常用的酶 - 底物系統主要有HRP(辣根過氧化物酶)-TMB/OPD和AP(堿性磷酸酶)-pNPP,不同系統的終止后信號穩定時間差異較大,需優先遵循試劑盒說明書的專屬要求:
 
酶 - 底物系統 終止液類型 終止后信號穩定時間(常規范圍) 讀數時間建議 信號變化趨勢(超時后)
HRP-TMB 稀硫酸(1-2M) 15-30分鐘 加終止液后立即混勻,10 分鐘內開始讀數,30 分鐘內完成 隨時間延長,藍色→黃色產物可能緩慢氧化,OD值輕微升高;超過 30 分鐘可能出現沉淀,OD值波動
HRP-OPD 稀硫酸(1-2M) 10-20分鐘 加終止液后 15 分鐘內必須完成讀數 黃色產物對光敏感,室溫下易褪色,OD值隨時間顯著降低
AP-pNPP 氫氧化鈉(0.5-1M) 20-40分鐘 加終止液后 20-35 分鐘內讀數 黃色產物穩定性略優于OPD,但超過 40分鐘后OD值可能因 pH 適應而輕微下降
 
    關鍵提醒:試劑盒說明書是最高準則。部分廠商會根據自家試劑的配方(如酶的純度、底物濃度、穩定劑成分)調整穩定時間,例如某些優化后的TMB底物可允許40分鐘內讀數,而部分OPD試劑盒可能要求 10 分鐘內完成。
 
三、確保讀數準確性的操作注意事項
1、加終止液后立即混勻
    終止液需與反應孔內的底物溶液充分混勻(可通過輕微震蕩酶標板或用移液器緩慢吹打 1-2 次),避免局部終止不徹底導致的 “孔內信號不均”—— 若混勻不充分,同一孔內不同區域的 OD 值差異可能超過 10%,直接影響結果。

2、
避免強光直射
    部分顯色產物(如 OPD、TMB 的氧化產物)對光敏感,加終止液后需將酶標板置于避光處(如蓋上酶標板蓋子、放在暗盒中),待所有孔加完終止液后立即讀數,防止光照導致的信號降解。
 
3、統一讀數時間點
    若檢測樣本量較大(如 96 孔板滿板),需規劃好加終止液的順序(如 “從第一列到第十二列” 依次添加),確保所有孔的 “終止后放置時間” 盡可能一致(差異不超過 5 分鐘)。例如:每加完一列(8 孔)耗時 1 分鐘,96 孔需 12 分鐘,加完最后一列后立即開始讀數,此時第一列的放置時間約為 12 分鐘,仍在 15-30 分鐘的穩定窗口內。
 
4、異常情況處理
    若因儀器故障等原因無法在規定時間內讀數,需記錄實際延遲時間,并在數據分析時備注(但延遲超過 30 分鐘的結果通常不建議采用,需考慮重新實驗);若發現部分孔出現沉淀,需先確認是否為正常現象(如部分試劑盒底物終止后可能有輕微絮狀物),若沉淀影響讀數,需聯系廠商技術支持判斷是否需重新檢測。
 
    加完終止液后的讀數時間需嚴格結合 “底物類型” 和 “試劑盒說明書”,核心是在 15-30 分鐘的常規穩定窗口內完成,同時通過 “充分混勻、避光、統一時間點” 等操作,最大程度保證讀數結果的準確性和重復性。