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ELISA試劑盒中的封閉液作用及常用成分有哪些?

日期:2025-08-28 14:43:12

    在ELISA實驗中,封閉液是保障檢測特異性、降低背景信號的關鍵試劑,其核心作用是 “阻斷固相載體(如酶標板孔)上未結合抗原/抗體的空白位點”,避免后續步驟中的抗體、酶標記物等非特異性吸附,從而減少假陽性或高背景干擾。以下從作用機制、常用成分、選擇原則三方面詳細解析:
 
一、封閉液的核心作用
    ELISA核心是 “抗原-抗體特異性結合”,但酶標板的聚苯乙烯表面存在大量疏水基團,除了結合目標抗原/抗體外,還可能非特異性吸附后續加入的一抗、二抗(尤其是酶標記二抗)—— 這種非特異性結合會導致 “即使沒有目標分子,酶也會催化顯色”,形成高背景(如孔底整體變藍),干擾結果判讀。
 
封閉液的作用正是解決這一問題,具體可拆解為3點:
    占據空白位點:封閉液中的蛋白質/大分子物質可與酶標板空白位點結合,形成 “物理屏障”,阻止后續抗體/酶標記物的非特異性吸附;
    不干擾特異性結合:封閉液成分需與目標抗原、抗體無交叉反應,僅結合空白位點,不影響 “抗原 - 一抗 - 二抗” 的特異性結合;
    維持反應環境:部分封閉液含緩沖成分(如 Tris、PBS),可維持體系 pH 穩定,保障酶活性和抗體結合能力。
 
二、常用封閉液成分及特點
    ELISA中封閉液的選擇需結合檢測體系(如抗原類型、抗體來源)、后續標記酶種類(如 HRP、AP)等因素,常用成分主要分為 “蛋白質類” 和 “非蛋白質類”,各類成分的特性及適用場景差異顯著:
 
封閉液類型 常用成分 核心特點 適用場景
蛋白質類(最常用) 脫脂奶粉(Skim Milk) 優勢:成本低、易獲取、封閉效果好,含多種蛋白質(酪蛋白為主),可高效占據空白位點;
劣勢:含內源性生物素、酶(如堿性磷酸酶),可能與檢測體系交叉反應。
適用于非生物素標記、非AP 酶系統的常規ELISA(如HRP標記二抗的抗原檢測),尤其適合經濟成本敏感的實驗。
牛血清白蛋白(BSA) 優勢:純度高(通常95%以上)、成分單一,無內源性生物素/酶,特異性強,背景信號極低;
劣勢:成本高于脫脂奶粉,封閉效率略低于脫脂奶粉(需較高濃度)。
適用于生物素-親和素系統、AP酶標記系統,或對背景信號要求極高的實驗(如低豐度靶標檢測、定量ELISA)。
正常動物血清(Normal Serum) 優勢:含該動物來源的多種蛋白質,可封閉針對該動物抗體的非特異性結合(如二抗為兔源,用正常兔血清封閉);
劣勢:成分復雜,可能含與目標抗原交叉反應的蛋白,需驗證適用性。
適用于間接ELISA(如用兔抗人一抗、羊抗兔二抗),可減少二抗與板底的非特異性結合,尤其適合多克隆抗體檢測。
非蛋白質類 酪蛋白(Casein) 優勢:脫脂奶粉的核心有效成分,經純化后不含脂肪和內源性酶,封閉效率高,穩定性好;
劣勢:溶解性略差,需充分攪拌溶解。
適用于對脫脂奶粉中 “雜質敏感” 的體系,或需長期儲存的封閉液(如商品化試劑盒配套封閉液)。
聚乙二醇(PEG,分子量 2000-20000) 優勢:非蛋白質大分子,無免疫原性,不與抗體交叉反應,適合特殊檢測體系;
劣勢:封閉效率較低,需較高濃度(通常2%-5%),易產生沉淀。
適用于抗原/抗體本身為蛋白質,且易與封閉蛋白交叉反應的特殊場景(如檢測小分子抗原、肽段抗原)。

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三、封閉液的選擇與使用注意事項
1. 核心選擇原則
    避免交叉反應:若檢測體系含生物素(如生物素標記一抗),禁用含內源性生物素的脫脂奶粉,優先選BSA;若用AP酶標記,禁用含內源性AP的封閉液(如部分動物血清);
    匹配抗體來源:間接ELISA中,若二抗為 “羊抗鼠”,可選用正常鼠血清封閉,減少二抗對板底的非特異性吸附;
    平衡效率與成本:常規定性檢測(如抗體篩查)選脫脂奶粉(經濟高效);精準定量或低背景需求選 BSA(純度高、特異性強)。
 
2. 使用注意事項
    濃度控制:多數封閉液的工作濃度為 1%-5%(如 1% BSA、5% 脫脂奶粉),濃度過低會導致封閉不充分(高背景),過高可能與目標抗原競爭結合位點(假陰性),需參照試劑盒說明書或預實驗驗證;
    溶解與過濾:脫脂奶粉、酪蛋白易產生絮狀物,溶解后需用 0.22μm 濾膜過濾,避免顆粒殘留導致孔底出現沉淀,干擾吸光度讀取;
    封閉時間與溫度:常規條件為37℃孵育 30-60 分鐘或4℃過夜孵育(封閉更充分,適合低豐度靶標),避免室溫長時間孵育(可能導致封閉蛋白變性);
    封閉后清洗:封閉結束后,需用含 Tween-20 的洗滌液(PBST)洗板 1-2 次,去除未結合的封閉蛋白,避免殘留封閉液與后續抗體反應。
 
    封閉液的核心價值是 “特異性保護空白位點”,其成分選擇需緊密匹配 ELISA 檢測體系,不合理的封閉液可能導致實驗失敗(如高背景、假陰性),因此建議優先參照試劑盒說明書選擇,或通過預實驗驗證不同封閉液的效果。