ELISA試劑盒是怎樣憑借信號(hào)強(qiáng)弱實(shí)現(xiàn)定量檢測？

日期：2025-08-22 14:32:07

ELISA試劑盒通過信號(hào)強(qiáng)弱實(shí)現(xiàn)定量檢測的核心邏輯是建立 “已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品的信號(hào)強(qiáng)度” 與 “未知樣本中目標(biāo)物濃度” 的對(duì)應(yīng)關(guān)系，具體過程可分為以下幾個(gè)關(guān)鍵步驟：

1. 標(biāo)準(zhǔn)品的梯度稀釋與信號(hào)生成

ELISA試劑盒中會(huì)提供已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（通常是高純度的目標(biāo)檢測物，如特定蛋白、抗體等）。實(shí)驗(yàn)時(shí)，需將標(biāo)準(zhǔn)品按比例進(jìn)行梯度稀釋（如 2倍、5倍稀釋），得到一系列濃度已知的標(biāo)準(zhǔn)溶液（例如 0ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、25ng/mL 等）。

將這些梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品與未知樣本一同加入ELISA反應(yīng)體系中，經(jīng)過抗原 - 抗體特異性結(jié)合、酶標(biāo)抗體結(jié)合、顯色反應(yīng)等步驟后，標(biāo)準(zhǔn)品會(huì)因濃度不同產(chǎn)生不同強(qiáng)度的信號(hào)（通常是顏色深淺，通過吸光度OD值衡量）：

標(biāo)準(zhǔn)品濃度越高，結(jié)合的酶標(biāo)抗體越多，催化顯色反應(yīng)生成的有色產(chǎn)物越多，信號(hào)（OD值）越強(qiáng)；

標(biāo)準(zhǔn)品濃度越低，信號(hào)（OD值）越弱。

2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以標(biāo)準(zhǔn)品的已知濃度為橫坐標(biāo)（X軸），以其對(duì)應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度（OD值）為縱坐標(biāo)（Y軸），通過擬合計(jì)算繪制出一條 “濃度 - 信號(hào)” 對(duì)應(yīng)曲線，即標(biāo)準(zhǔn)曲線。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方式通常有以下幾種：

線性擬合：適用于信號(hào)與濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系的情況；

對(duì)數(shù)擬合：當(dāng)濃度范圍較寬時(shí)，信號(hào)與濃度可能呈對(duì)數(shù)關(guān)系；

四參數(shù)logistic擬合（4-PL）：ELISA中最常用的擬合方式，能更準(zhǔn)確地反映信號(hào)與濃度的非線性關(guān)系（尤其在高濃度平臺(tái)期和低濃度起始期）。

合格的標(biāo)準(zhǔn)曲線需滿足相關(guān)系數(shù)（R²）≥0.98，確保濃度與信號(hào)的對(duì)應(yīng)關(guān)系可靠。

3. 未知樣本濃度的計(jì)算

未知樣本經(jīng)過同樣的反應(yīng)流程后，會(huì)產(chǎn)生一個(gè)特定的信號(hào)強(qiáng)度（OD值）。將該OD值代入已繪制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，通過反向查找或公式計(jì)算，即可得到未知樣本中目標(biāo)物的濃度。

例如：若未知樣本的OD值為0.8，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)的 X 軸濃度為10ng/mL，則該樣本中目標(biāo)物濃度即為10ng/mL（若樣本經(jīng)過稀釋，需乘以稀釋倍數(shù)得到實(shí)際濃度）。

關(guān)鍵原理總結(jié)

ELISA定量的本質(zhì)是利用抗原 - 抗體反應(yīng)的特異性和酶催化反應(yīng)的放大效應(yīng)：

目標(biāo)物濃度越高，結(jié)合的酶分子越多，催化產(chǎn)生的有色產(chǎn)物越多，信號(hào)越強(qiáng)；

標(biāo)準(zhǔn)曲線建立了信號(hào)與濃度的數(shù)學(xué)關(guān)系，從而實(shí)現(xiàn)未知樣本的定量。