酵母三雜交技術(shù)實驗原理
日期：2023-07-13 16:13:57
酵母三雜交技術(shù)（yeast three-hybrid, Y3H）是常用的分子生物學(xué)實驗方法，用于研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。它基于酵母細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄激活因子（transcriptional activator）的特性，通過檢測目標(biāo)蛋白質(zhì)與其他蛋白質(zhì)的相互作用來篩選相互作用伴侶。
檢測報告基因的表達(dá)：
結(jié)果分析：
以下是酵母三雜交技術(shù)的實驗原理步驟：
構(gòu)建酵母菌株：
構(gòu)建一個酵母菌株，其中包含兩個可表達(dá)靶蛋白（target protein）和激活域（activation domain）的融合蛋白。這些融合蛋白通過基因工程方法將其編碼序列與適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)元件結(jié)合在一起。
酵母菌株中也含有一個報告基因（reporter gene），它的啟動子區(qū)域包含識別序列（binding site）。這個識別序列可以被激活域識別并結(jié)合。
共表達(dá)被檢測蛋白與靶蛋白：
引入第三個外源基因，這個基因編碼一個與被檢測蛋白（bait protein）相互作用的蛋白質(zhì)（prey protein）。這個蛋白質(zhì)會與靶蛋白形成復(fù)合物。
靶蛋白和激活域的融合蛋白同時表達(dá)，形成復(fù)合物。
檢測報告基因的表達(dá)：
如果被檢測蛋白與靶蛋白相互作用，它們會結(jié)合并促使激活域與識別序列結(jié)合，從而激活報告基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。
報告基因可以是編碼可觀察性標(biāo)記物的基因，如熒光蛋白基因，或者編碼對酵母細(xì)胞存活有影響的基因。
結(jié)果分析：
觀察報告基因的表達(dá)情況，如果報告基因表達(dá)增加，則說明被檢測蛋白與靶蛋白發(fā)生相互作用。
可以通過熒光顯微鏡觀察細(xì)胞中的熒光信號，或者通過其他方法測定報告基因產(chǎn)物的量。
通過酵母三雜交技術(shù)，研究人員可以篩選出與目標(biāo)蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)合伴侶蛋白，以進(jìn)一步研究它們在細(xì)胞中的生物學(xué)功能和信號傳導(dǎo)途徑。
