單克隆抗體制備過程，若免疫后動物未產(chǎn)生有效抗體，可能的原因（如抗原免疫原性弱、免疫方案不當）有哪些，該如何調(diào)整實驗方案？

日期：2025-09-28 09:22:59

在單克隆抗體制備中，免疫后動物未產(chǎn)生有效抗體（通常以血清效價低或無特異性結(jié)合為判斷標準）是常見問題，核心原因可歸結(jié)為抗原本身特性、免疫方案設(shè)計、動物個體差異三大類，需針對性分析并調(diào)整實驗方案。

一、核心原因分析

1.抗原相關(guān)因素（最主要原因）

抗原的免疫原性直接決定動物免疫系統(tǒng)能否被有效激活，是產(chǎn)生抗體的基礎(chǔ)。

（1）免疫原性極弱：

小分子抗原（如分子量＜1kDa的多肽、激素、藥物）、高度保守的自身抗原（如人體同源性＞95%的蛋白）或結(jié)構(gòu)簡單的抗原（如單糖、脂類），因缺乏足夠的“異物信號”和免疫識別表位，難以被動物B細胞識別和呈遞。

例如：純化的人源白蛋白免疫小鼠時，因小鼠與人類白蛋白同源性高，常難以產(chǎn)生高滴度抗體。

（2）抗原純度不足或結(jié)構(gòu)破壞：

抗原中混有大量雜蛋白（如原核表達的包涵體未徹底純化）、內(nèi)毒素或降解片段，會分散免疫系統(tǒng)的應(yīng)答焦點，導(dǎo)致針對目標抗原的特異性抗體減少；若抗原在純化/儲存中發(fā)生變性（如高溫、反復(fù)凍融破壞空間構(gòu)象），則其天然表位消失，無法誘導(dǎo)特異性免疫。

（3）抗原劑量失衡：

劑量過低時，不足以激活免疫系統(tǒng)；劑量過高（尤其是可溶性抗原）可能誘導(dǎo)免疫耐受——免疫系統(tǒng)將高濃度抗原識別為“自身成分”，反而抑制B細胞活化（如過量的重組細胞因子免疫動物）。

2.免疫方案設(shè)計缺陷

即使抗原免疫原性尚可，不合理的免疫流程也會導(dǎo)致應(yīng)答失敗。

（1）免疫途徑不當：

不同途徑的抗原遞呈效率差異極大。例如，僅采用腹腔注射可溶性抗原時，抗原易被快速清除，難以有效激活樹突狀細胞（DC）和T細胞；而皮內(nèi)注射（含佐劑）可通過刺激局部淋巴結(jié)，顯著提升免疫應(yīng)答。

（2）佐劑選擇或使用錯誤：

佐劑的核心作用是延長抗原滯留時間、激活固有免疫細胞（如巨噬細胞），增強抗原免疫原性。若未使用佐劑（尤其針對可溶性抗原）、佐劑種類不當（如用弗氏不完全佐劑做首次免疫，缺乏免疫激活成分），或佐劑與抗原混合不均（如乳化不徹底，抗原快速釋放），都會導(dǎo)致免疫應(yīng)答微弱。

（3）免疫間隔與次數(shù)不合理：

免疫間隔過短（如＜7天），動物免疫系統(tǒng)尚未完成B細胞增殖分化，無法產(chǎn)生有效記憶細胞；間隔過長（如＞30天），初次免疫的記憶細胞衰減，難以疊加應(yīng)答；免疫次數(shù)不足（如僅1-2次），則無法達到抗體效價峰值。

（4）抗原與佐劑比例失衡：

抗原過多而佐劑不足，無法有效“包裹”抗原；佐劑過多而抗原不足，可能引發(fā)過度炎癥反應(yīng)，反而抑制特異性免疫。

3.動物個體與生理狀態(tài)影響

（1）品系不匹配：

不同近交系小鼠的MHC（主要組織相容性復(fù)合體）基因型不同，對同一抗原的識別能力差異極大。例如，C57BL/6小鼠對某些病毒抗原應(yīng)答強，而BALB/c小鼠對細菌抗原應(yīng)答更優(yōu)，選錯品系可能導(dǎo)致無應(yīng)答。

（2）年齡與健康狀態(tài)：

幼年動物（＜6周齡）免疫系統(tǒng)未成熟，老年動物（＞8月齡）免疫功能衰退，均難以產(chǎn)生強應(yīng)答；動物若感染病原體（如小鼠肝炎病毒）、存在免疫缺陷（如SCID小鼠）或應(yīng)激狀態(tài)（如飼養(yǎng)環(huán)境惡劣），也會抑制免疫反應(yīng)。

（3）性別差異：

雌性動物（尤其是未孕狀態(tài)）的體液免疫應(yīng)答通常強于雄性，部分抗原（如性激素相關(guān)抗原）可能因性別差異導(dǎo)致應(yīng)答不同。

二、實驗方案調(diào)整策略

1.針對“抗原問題”的核心調(diào)整

（1）增強抗原免疫原性（最關(guān)鍵）：

小分子/弱免疫原性抗原：采用“載體偶聯(lián)法”，將抗原與強免疫原性載體（如KLH、BSA、OVA）交聯(lián)（通過EDC、戊二醛等交聯(lián)劑），利用載體的表位激活T細胞，間接輔助B細胞活化。例如，多肽抗原需優(yōu)先偶聯(lián)KLH后再免疫。

自身抗原：①選擇與目標物種親緣關(guān)系較遠的動物（如人源抗原免疫大鼠而非小鼠）；②對自身抗原進行修飾（如磷酸化、甲基化）或截取非保守片段，打破免疫耐受；③采用“異種同源抗原聯(lián)合免疫”（如人+猴同源抗原混合免疫）。

變性抗原：重新制備/純化抗原，確保其天然構(gòu)象（如采用哺乳動物細胞表達系統(tǒng)替代原核系統(tǒng)，避免包涵體變性；儲存時采用-80℃分裝凍存，避免反復(fù)凍融）。

（2）優(yōu)化抗原純度與劑量：

純度：通過層析（如Ni柱、凝膠過濾）、電泳純化等方法，將抗原純度提升至＞90%，去除雜蛋白和內(nèi)毒素（內(nèi)毒素含量需＜0.1EU/μg）。

劑量：根據(jù)抗原類型調(diào)整，可溶性抗原通常首次免疫劑量為50-100μg/只（小鼠），加強免疫為25-50μg/只；顆粒性抗原（如病毒、細胞）劑量可減半（25-50μg/只），避免免疫耐受。

2.針對“免疫方案”的系統(tǒng)優(yōu)化

（1）調(diào)整免疫途徑：

優(yōu)先選擇“皮內(nèi)多點注射”（背部或腹部，4-6點）或“淋巴結(jié)周圍注射”（如小鼠腋窩、腹股溝淋巴結(jié)附近），利用局部淋巴結(jié)的抗原遞呈優(yōu)勢；首次免疫可結(jié)合“腹腔注射”，加強免疫采用“皮下+腹腔聯(lián)合注射”，提升應(yīng)答效率。

（2）優(yōu)化佐劑選擇與使用：

首次免疫：必須使用弗氏完全佐劑（CFA），其含分枝桿菌成分，可強效激活巨噬細胞和DC細胞；加強免疫改用弗氏不完全佐劑（IFA），避免CFA的過度炎癥反應(yīng)。

替代佐劑：若對CFA的刺激性敏感，可選用鋁佐劑（適用于蛋白抗原）、ISCOM（免疫刺激復(fù)合物，適用于膜蛋白）或商品化佐劑（如Sigma的MPL+TDM佐劑），需提前預(yù)實驗驗證效果。

乳化要求：抗原與佐劑按1:1體積比混合，采用雙注射器反復(fù)推注至“水滴法不擴散”（滴入水中呈球形不分散），確保抗原緩慢釋放。

（3）修正免疫間隔與次數(shù)：

標準流程：首次免疫后，間隔14天進行第一次加強免疫，再間隔14天進行第二次加強免疫；加強免疫后7-10天采血檢測血清效價，若效價低，可追加1次加強免疫（間隔7天），避免過度免疫。

3.針對“動物因素”的調(diào)整

（1）更換動物品系：

若原品系（如BALB/c）無應(yīng)答，可換用免疫應(yīng)答更強的品系（如C57BL/6、ICR小鼠，或大鼠），優(yōu)先選擇近交系動物（遺傳背景均一，應(yīng)答穩(wěn)定）。

（2）選擇適齡健康動物：

選用6-8周齡、體重18-22g的雌性小鼠（體液免疫應(yīng)答強），確保動物無病原體感染（SPF級最佳），飼養(yǎng)環(huán)境穩(wěn)定（溫度22-25℃、濕度40%-60%，避免應(yīng)激）。

（3）預(yù)免疫篩選：