流式抗體用于分選實(shí)驗(yàn)時(shí)，與僅用于分析的抗體相比，在純度、活性和熒光素穩(wěn)定性上是否有更高要求？
日期：2025-09-12 13:45:47
流式抗體用于分選實(shí)驗(yàn)（如流式細(xì)胞分選，F(xiàn)ACS）時(shí)，與僅用于分析的抗體相比，在純度、活性和熒光素穩(wěn)定性上確實(shí)有更高要求，這與分選實(shí)驗(yàn)的核心目標(biāo)（獲得活的、高純度的目標(biāo)細(xì)胞群，且不影響后續(xù)功能研究）直接相關(guān)。具體差異如下：
一、純度要求更高
分析用抗體：主要用于識(shí)別目標(biāo)細(xì)胞并通過(guò)熒光信號(hào)進(jìn)行定性/定量分析，允許存在少量非特異性雜質(zhì)（如未結(jié)合的熒光素、微量雜蛋白），只要不顯著干擾熒光信號(hào)的特異性即可。
分選用抗體：需與細(xì)胞表面抗原穩(wěn)定結(jié)合，且殘留雜質(zhì)可能直接影響分選細(xì)胞的活性或后續(xù)功能。例如：
若抗體中含有未純化的游離熒光素，可能非特異性吸附到細(xì)胞表面，導(dǎo)致分選時(shí)“假陽(yáng)性”細(xì)胞被誤選，降低分選純度；
若存在雜蛋白（如血清成分、細(xì)胞培養(yǎng)污染物），可能引發(fā)細(xì)胞聚集、激活或毒性反應(yīng)，影響分選后細(xì)胞的存活或功能（如后續(xù)培養(yǎng)、增殖、分化實(shí)驗(yàn)）。
標(biāo)準(zhǔn)差異：分選用抗體通常需經(jīng)過(guò)更嚴(yán)格的純化步驟（如ProteinA/G親和層析+離子交換層析），確保抗體純度＞95%，且無(wú)游離熒光素、內(nèi)毒素、蛋白酶等污染物。
二、活性要求更嚴(yán)格
分析用抗體：只需能特異性結(jié)合目標(biāo)抗原并產(chǎn)生可檢測(cè)的熒光信號(hào)即可，對(duì)結(jié)合親和力的“持續(xù)性”要求較低（分析過(guò)程通常僅需數(shù)十分鐘至1小時(shí)）。
分選用抗體：需滿足兩個(gè)核心需求：
高特異性結(jié)合：避免與非目標(biāo)細(xì)胞的交叉反應(yīng)，否則會(huì)導(dǎo)致分選細(xì)胞群中混入雜質(zhì)細(xì)胞（分選純度下降）；
穩(wěn)定結(jié)合能力：分選過(guò)程（尤其是大規(guī)模分選）可能耗時(shí)數(shù)小時(shí)，抗體需在孵育、洗滌、分選的全過(guò)程中保持與抗原的穩(wěn)定結(jié)合，不輕易解離，否則會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)細(xì)胞熒光信號(hào)減弱，被誤判為陰性細(xì)胞而丟失。
額外要求：分選用抗體需對(duì)細(xì)胞毒性極低。分析用抗體即使有輕微毒性，僅影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性；但分選后細(xì)胞常需用于后續(xù)培養(yǎng)、功能實(shí)驗(yàn)（如細(xì)胞擴(kuò)增、測(cè)序、移植等），若抗體本身或其偶聯(lián)物（如熒光素）具有細(xì)胞毒性，會(huì)直接導(dǎo)致細(xì)胞死亡或功能異常。因此，分選用抗體需經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的細(xì)胞毒性驗(yàn)證（如檢測(cè)分選后細(xì)胞的存活率、增殖能力）。
三、熒光素穩(wěn)定性要求更高
分析用抗體：熒光素需在流式分析的短時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定（避免光漂白或淬滅），但對(duì)長(zhǎng)期穩(wěn)定性（如分選過(guò)程中的持續(xù)照射）要求較低。
分選用抗體：分選過(guò)程中，細(xì)胞需經(jīng)過(guò)激光多次照射（用于識(shí)別熒光信號(hào)并觸發(fā)分選），且分選時(shí)間可能長(zhǎng)達(dá)數(shù)小時(shí)，熒光素需具備更強(qiáng)的抗光漂白能力：
若熒光素穩(wěn)定性不足，會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)細(xì)胞的熒光信號(hào)強(qiáng)度逐漸下降，分選儀器可能無(wú)法有效識(shí)別，造成目標(biāo)細(xì)胞丟失或分選效率降低；
此外，分選后的細(xì)胞若需進(jìn)行二次檢測(cè)（如驗(yàn)證分選純度），熒光信號(hào)的穩(wěn)定性也需保持，避免結(jié)果偏差。
常用熒光素差異：分選實(shí)驗(yàn)更傾向于選擇穩(wěn)定性更高的熒光素（如APC、PE-Cy7等），而某些易淬滅的熒光素（如FITC）在分選時(shí)需更嚴(yán)格控制光照條件，或優(yōu)先選擇其穩(wěn)定衍生物。
分選用流式抗體因需保障目標(biāo)細(xì)胞的高純度、高活性及后續(xù)功能完整性，在純度（減少雜質(zhì)干擾）、活性（特異性強(qiáng)且結(jié)合穩(wěn)定，低毒性）、熒光素穩(wěn)定性（抵抗長(zhǎng)時(shí)間激光照射）上的要求顯著高于僅用于分析的抗體。實(shí)際應(yīng)用中，需優(yōu)先選擇明確標(biāo)注“適合分選FACS-suitable”的抗體，并通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其對(duì)分選效率和細(xì)胞活性的影響。
